Исследовательская группа из Пермского Политехнического университета и Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН совершила прорыв, извлекая фермент из бактерий, адаптированных к условиям содового шламохранилища.
Ирина Медведева
Культивирование микроорганизмов в ламинарном боксе. Автор и источник: Пресс-служба ПНИПУ
Как сообщает пресс-служба ПНИПУ, модифицированные формы данного фермента демонстрируют 95–97% сохранения исходной активности и функционируют на 50–100% продолжительнее современных рыночных препаратов.
Данное исследование направлено на сокращение расходов на дорогостоящие минеральные добавки. Результаты работы опубликованы в издании «Прикладная биохимия и микробиология». Работа выполнена в рамках программы стратегического развития «Приоритет 2030».
Фосфор — необходимый элемент для живых организмов
Фосфор является ключевым элементом в агрономии и животноводстве. Для животных он служит основой костной системы и метаболических процессов, а для растений критически важен для формирования корневой системы и окончательного формирования урожая. Однако значительная часть фосфора, содержащегося естественным образом в почве и кормовых смесях, представлена в форме, которую живые организмы не могут усвоить. Для решения этой проблемы требуются особые ферменты, повышающие биодоступность элемента.
Существующие коммерческие препараты обладают существенным недостатком: они быстро деградируют при термической обработке, утрачивая эффективность, что делает невозможным их повторное применение. Это приводит к необходимости увеличения объемов покупки добавок, повышая общую стоимость растениеводства и животноводства.
Хотя данный элемент в достаточном количестве имеется в почве и кормах, он существует в биологически инертной форме и не может быть использован организмами. Это ведет к негативным последствиям: животные становятся более подвержены заболеваниям, их иммунитет снижается, наблюдается ослабление костной ткани, а также падает продуктивность. У растений дефицит доступного фосфора проявляется в замедленном развитии, позднем цветении, уменьшении размеров плодов и общей урожайности.
Фитаза — ключ к усвоению фосфора
Для трансформации «запертого» фосфора в доступную форму необходим специфический фермент фитаза. Этот белковый катализатор управляет биохимическими реакциями и расщепляет фитиновые кислоты и их соединения, присутствующие в зерне, семенах и кормах, тем самым освобождая фосфор для усвоения. Фитаза повышает степень усвоения данного минерала и позволяет уменьшить зависимость от дорогих дополнительных компонентов.
Простыми словами, фитаза помогает высвобождать фосфор из фитатов солей фитиновой кислоты, которые содержатся в растительных кормах. Фитаза расщепляет сложноэфирные связи фосфорной кислоты в молекуле фитиновой кислоты.
Особенность фитатов: они действуют как антипитательный фактор — связывают кальций, железо, микроэлементы и аминокислоты, что затрудняет их переваривание и усвоение.
Фитазы используют в сельском хозяйстве в качестве кормовых добавок для домашних животных, свиней, птицы. Это позволяет: увеличить доступность фосфора из растительных кормов; улучшить усвоение кальция, микроэлементов, белков, аминокислот; повысить энергетическую ценность кормов.
Эксперимент по определению активности фермента. Автор и источник: Пресс-служба ПНИ
Применять фитазу в свободном, растворенном состоянии — простой, но малоэффективный подход, поскольку природная фитаза крайне чувствительна к условиям внешней среды. Под воздействием температуры, колебаний уровня кислотности или даже при длительном хранении она стремительно теряет каталитические свойства. В итоге большая часть фермента деградирует прежде, чем выполнит свою задачу, делая его применение экономически нецелесообразным.
Альтернативный метод — иммобилизация, то есть фиксирование фермента на твердой подложке. Такой подход увеличивает устойчивость к высоким температурам и снижает скорость разрушения. Но классические методики иммобилизации, используемые учеными, также часто приводят к существенной потере активности катализатора (до 30–50%).
Сложности изготовления кормов с фитазами
Большая производственная проблема при изготовлении кормов с фитазами — их деактивация под влиянием высоких температур в процессе обработки.
Фермент существенно теряет эффективность, что требует его внесения в увеличенных объемах для достижения эффекта.
Другая проблема — узкая область оптимальной активности большинства фитаз преимущественно кислая сред, аналогичная желудочному содержимому. В других участках пищеварительного тракта активность фермента резко снижается, что уменьшает итоговое усвоение фосфора и также требует увеличения дозировки.
Таким образом, для сельского хозяйства крайне необходим фермент, способный выдерживать температурные нагрузки при производстве кормов, функционировать в меняющихся внешних условиях и сохранять работоспособность после нескольких циклов применения.
Фермент получен из содового шламохранилища
Специалисты из Пермского Политеха и Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН первыми получили фитазу из бактериальных культур, обитающих в среде содового шламохранилища.
Данный фермент отличается более медленной деградацией при нагревании, сохраняет активность в широком спектре кислотности и функционирует на 50–100% дольше, чем имеющиеся на рынке аналоги.
Для выделения была выбрана именно среда шламохранилища, так как она характеризуется агрессивными параметрами, высокой щелочностью и повышенной концентрацией солей. Микроорганизмы, адаптированные к таким условиям, обладают повышенной устойчивостью к негативным внешним воздействиям. Эта устойчивость потенциально позволяет применять их в условиях нагрева и переменных значений pH.
Фермент, иммобилизованный в альгинатном геле. Автор и источник: Пресс-служба ПНИПУ
Метод фиксации фитазы на твердой основе
Из выделенных бактериальных культур получен целевой фермент фитаза. Однако природный фермент, представляющий собой растворенный белок, требовал фиксации на твердой основе.
«Мы испытали два известных метода фиксирования. Первый физический: раствор фермента был внесен в гель на основе альгината (вещества, получаемого из бурых водорослей), которому затем была придана форма мелких шариков, содержащих внутри фитазу.
Второй метод химический: фермент был присоединен к поверхности гранул, изготовленных из хитозана (материала, производимого из покровов ракообразных). Эти материалы были выбраны по причине их широкого применения в биотехнологии: они нетоксичны, экономичны и безопасны для животных и растений», пояснила Ксения Иванова, студентка кафедры «Химия и биотехнология» ПНИПУ.
Эксплуатационные характеристики фермента
Но даже при использовании стандартных методов иммобилизации для каждого конкретного ферментного образца требуется оценивать воздействие фиксации на твердом носителе на итоговые эксплуатационные характеристики.
Исследователи измеряли уровень сохранения активности после воздействия различных температур и значений кислотности, а также после многократного циклического использования.
«Мы сравнили полученные образцы с другими фитазами, уже применяющимися в сельском хозяйстве. Анализ показал, что фиксация на носителе позволила сохранить 95–97% исходной активности. У других коммерческих препаратов после иммобилизации активность обычно снижается до уровня 50–70%.
Наш фермент также сохранял функциональность в очень широком интервале pH от 3 до 12. У аналогов рабочий диапазон существенно более узкий: большинство активны лишь в кислой среде (pH 4–6), а при увеличении pH быстро деактивируются», сообщила Юлия Максимова, руководитель лаборатории молекулярной биотехнологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.
Важный вывод эксперимента связан с продолжительностью эффективного использования фермента. После шести последовательных рабочих циклов иммобилизованная фитаза сохраняла около 70% первоначальной активности. Это означает возможность многократного применения одного и того же препарата, что значительно сокращает расходы.
Для сравнения: существующие рыночные фитазы после 4–5 циклов применения имеют не более 50–60% активности. У некоторых аналогичных продуктов этот показатель опускается до 38–43%. Таким образом, разработка пермских исследователей работает на 50–100% дольше, чем известные ферментные продукты.